La prueba Colilert utiliza la tecnología de sustrato definido (DST) patentada para detectar simultáneamente coliformes totales y E. coli. Dos indicadores de nutrientes, ONPG y MUG, son las principales fuentes de carbono en Colilert y pueden ser metabolizados por la enzima coliforme β-galactosidasa y la enzima E. coli β-glucuronidasa, respectivamente.
A medida que los coliformes crecen en la prueba de Colilert, usan β-galactosidasa para metabolizar ONPG y cambiarlo de incoloro a amarillo.
E. coli usa β-glucuronidasa para metabolizar MUG y crear fluorescencia. Como la mayoría de los no coliformes no tienen estas enzimas, son incapaces de crecer e interferir. Los pocos no coliformes que tienen estas enzimas son suprimidos selectivamente por la matriz específicamente formulada de Colilert Test.
Este enfoque es diferente de los medios tradicionales, que proporcionan un entorno rico en nutrientes que respalda el crecimiento de los organismos objetivo y de los no objetivos. Cuando los no objetivos crecen e imitan a los organismos objetivo, se producen falsos positivos. El crecimiento de los no objetivos también puede suprimir los organismos objetivo y dar falsos negativos en los medios tradicionales. Para suprimir los no objetivos, los medios tradicionales a menudo incluyen altos niveles de sales, detergentes u otros agentes selectivos que pueden suprimir inadvertidamente los organismos objetivo y dar falsos negativos adicionales.