Microscopios. Cómo elegir el mejor para tu necesidad

La microscopía se utiliza en la mayoría de las disciplinas de ciencias de la vida y en entornos académicos, clínicos y comerciales. Más allá de las ciencias de la vida, la microscopía es una herramienta de análisis firmemente establecida en el área de materiales, formulación y tecnología de la información.

Las tecnologías y aplicaciones de la microscopía son diversas y progresivas. Esta guía proporciona una descripción general de las técnicas actuales relacionadas con la microscopía, características clave y consideraciones de aplicación. Sin embargo, la microscopía de infrarrojos y FTIR no se incluye en esta guía, ya que ésta se centra principalmente en las ciencias de la vida en lugar de la ciencia de los materiales o la fabricación de TI.

Cómo elegir un microscopio, preguntas a realizar

La principal consideración para todos los tipos de microscopía es su aplicación y lo que ello puede involucrar. Algunas consideraciones generales pueden incluir:

Tipo de muestra

¿Qué muestras utilizarás y cómo las prepararás? ¿Utilizarás células vivas o células fijas, secciones completas de tejido o cultivos bacterianos? Por ejemplo, las células pueden recolectarse y luego montarse en portaobjetos o verse como una capa bidimensional de células en la parte inferior de un pocillo de microplaca.

Tiempo del experimento

¿Con qué frecuencia utilizará el microscopio y cuánto durará cada sesión? Esto puede afectar el fotoblanqueo de la muestra y, a su vez, su elección de iluminación. Además, ¿su cámara de imágenes permite la obtención de imágenes ininterrumpidas durante la noche o durante el fin de semana, para no tener que regresar siempre a capturar datos? Por ejemplo, el IncuCyte de Sartorius permite obtener imágenes longitudinales de células en vivo para que siempre esté obteniendo datos, incluso cuando no está.

Número de la muestra

¿Cuántas muestras vas a estar analizando? Los laboratorios de patología pueden necesitar una máquina de alto rendimiento para manejar las muchas muestras que se analizan todos los días, mientras que un grupo de investigación puede beneficiarse de especificaciones más altas y un rendimiento más bajo para un examen detallado de muestras.

Resolución de la imagen

¿Qué nivel de detalle requiere en su imagen? ¿Vas a ver la morfología general de un tejido en un sólo plano de imagen? ¿O estás midiendo la localización intracelular de biomoléculas a lo largo de múltiples acumulaciones de Z? ¿Estás contando las células o las bacterias con un aumento menor, o estás mirando la interacción proteína-proteína dentro de las células, lo que requiere una mayor resolución?

Etiquetado

¿Sus muestras estarán etiquetadas o no? Si sus muestras están etiquetadas de forma fluorescente, ¿tu microscopio soporta las longitudes de onda? ¿Puedes ver múltiples biomoléculas con múltiples canales fluorescentes?

Cuantitativo versus cualitativo

¿Cómo quieres usar tus imágenes? ¿Está generando imágenes de alta resolución como "representante" de tu cohorte sólo para su visualización y publicación? ¿O quieres usarlos también para el análisis cuantitativo?

Alto rendimiento y automatización

¿Procesará su laboratorio múltiples muestras a la vez, arriesgándose a un error humano? Si es así, es posible que deba considerar si su microscopio es compatible con los sistemas de automatización. Cuando realice imágenes de células vivas, considere una incubadora incorporada o conectada para mantener las células sanas mientras procesa varias muestras.

Microscopía de luz

En su forma más simple, el microscopio de luz está compuesto por una lente transparente que magnifica la muestra y una fuente de luz para iluminarla. Sin embargo, la mayoría de los microscopios de luz son mucho más complejos, con numerosas lentes afinadas y dimensiones estrechamente controladas, todo dentro del cuerpo del propio microscopio y en sus componentes como los objetivos y los oculares.

Muestras completas

Para la observación de muestra completa, por ejemplo, durante las disecciones, se pueden usar microscopios estereoscópicos, generalmente de campo amplio.
Proporcionan las magnificaciones más bajas para obtener una imagen general de la muestra. Tales microscopios estereoscópicos tienden a utilizar la luz reflejada por la muestra en lugar de transmitirla a través de ella.
La mayoría de los microscopios de campo amplio tienen campo claro y campo oscuro y la visualización de contraste de fase, que ofrece diferentes contrastes y vistas de sus imágenes.

Microscopía de campo amplio frente a microscopía confocal

En la microscopía de campo amplio, la fuente de luz ilumina toda la muestra de una sola vez, lo que proporciona un "panorama general" de la muestra, mientras que la microscopía confocal se enfoca en la región de interés al restringir cualquier luz no enfocada y aumenta la resolución de la imagen.

Microscopio vertical vs. invertido

Los microscopios invertidos se están desarrollando cada vez más y están siendo disponibilizados en el mercado a medida que sus aplicaciones se vuelven más avanzadas. Los montantes verticales siguen siendo la mejor opción para algunas aplicaciones, como el análisis de embriones de pez cebra o secciones de tejido teñido, pero para la mayoría de las aplicaciones de imágenes celulares existentes y emergentes, es preferible el microscopio invertido.

Células sin marcar versus células marcadas

Las células sin etiquetar generalmente proporcionan un contraste limitado con el fondo, por lo que una buena iluminación es importante.
La iluminación halógena ha sido el estándar de oro para la microscopía de luz, sin embargo, las fuentes de luz LED son cada vez más comunes y ofrecen la ventaja de no calentar la muestra, reducen el consumo de energía y prolongan la vida útil con la advertencia de que alteran los colores en una muestra teñida.
Los creadores de imágenes modernos están programados para ofrecer un mejor contraste y producir recuentos de células más precisos. Pregunte acerca de la capacidad del software para producir perfiles de intensidad nítidos para obtener mejores conteos.

Imagen confocal

La microscopía confocal, particularmente con el uso de imágenes fluorescentes, es ahora una tecnología líder para las ciencias de la vida.
Es una adaptación de la microscopía de luz, que ofrece una resolución mejorada sobre la microscopía de campo amplio. La clave para ésto es la forma restringida en que la luz llega al fotomultiplicador a través de un orificio. Esto restringe la cantidad de luz desenfocada que se captura de la muestra, aumenta el contraste y aumenta drásticamente la resolución de lo que estás viendo.
Hay varios tipos diferentes de microscopía confocal:

• Microscopía confocal de barrido láser (LSCM): Permite el seccionamiento óptico, es decir, la obtención de imágenes ópticos laminares de hasta 500 nanómetros a partir de muestras más gruesas.
• Imagen confocal de fluorescencia: permite imágenes de fluoróforos de alta resolución.
• Imagen confocal avanzada: estas son variantes de microscopía confocal para aplicaciones específicas, por ejemplo, FRET y FRAP.

La microscopía confocal ofrece la capacidad de controlar la profundidad del campo, la eliminación o reducción de la información de fondo y la capacidad de recopilar secciones desde muestras más gruesas. La relación señal / ruido se mejora significativamente sobre la microscopía de campo amplio, y se puede utilizar con muestras tanto vivas como fijas, lo que hace posible producir imágenes en 3D de estructuras celulares.

Microscopía confocal de barrido láser (LSCM)

Un microscopio de escaneo láser confocal escanea una muestra secuencialmente, punto por punto, o múltiples puntos a la vez. La información de los píxeles se ensambla luego en una imagen. Esto se deriva de la microscopía confocal para permitir al usuario adquirir imágenes 3D sofisticadas de su muestra, o estructuras individuales dentro de de ella. En cualquier posición focal, un microscopio de escaneo láser confocal puede obtener múltiples imágenes sobre una selección de diferentes profundidades y luego combinarlas para crear una imagen compuesta en 3D, una técnica llamada seccionamiento óptico.

Microscopía de fluorescencia

Los microscopios de fluorescencia llevan las imágenes celulares un paso más allá que los de campos brillantes o los de contrastes de fase.
Con el uso de fluoróforos, aplicados por vía tópica, expresados genéticamente o por inmunofluorescencia, la microscopía de fluorescencia ayuda a capturar la localización de las moléculas objetivo involucradas en la señalización celular, apoptosis, viabilidad celular u otras vías de biología celular.
Las mode

rnas cámaras de imágenes permiten a los usuarios alternar entre imágenes de campo claro, contraste de fase y fluorescencia. Con múltiplescanales de fluorescencia para la superposición de imágenes, puede realizar etiquetado múltiple y co-localización al estudiar células in vitro o fijas en una lámina. También se puede emplear para actividades cotidianas de cultivo celular, como medir la confluencia celular o garantizar la eficiencia de la transfección.

Etiquetas y tintes fluorescentes: el uso de la fluorescencia en microscopía permite un análisis más específico de una muestra. Las células y los tejidos pueden teñirse o marcarse con uno o más tintes, para permitir la visualización compleja de estructuras, como núcleos o proteínas. Por ejemplo, el DRAQ5TM es un tinte nuclear selectivo, mientras que el DRAQ7TM tiñe selectivamente células muertas, moribundas y apoptóticas. La GFP (proteína verde fluorescente) o luciferasa de luciérnaga se puede expresar dentro de las células y fusionar con una proteína de interés, dando muestras listas para la obtención de imágenes. Del mismo modo, la inmunofluorescencia utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia para dirigirse a las estructuras de interés.

Las etiquetas fluorescentes varían en intensidad de señal y en la cantidad de fluorescencia de fondo. Si una muestra se va a ver durante mucho tiempo, por ej. para la captura de imágenes en vivo y el seguimiento de eventos celulares, es necesario abordar el fotoblanqueo del fluoróforo; ésto puede afectar su elección de la etiqueta. Considere también su aplicación: para los análisis de células vivas, las sondas fluorescentes deben ser permeables a la membrana celular para evaluar la estructura y la función dentro de la célula.
Se pueden usar múltiples marcas para etiquetar la misma muestra, a menudo co-localizadas en la misma parte de la muestra. Debe asegurarse de seleccionar un microscopio que le permita visualizar su paleta de etiquetas. También debe considerar la cantidad de etiquetas que desea utilizar y asegurarse de que el microscopio puede ajustar los tintes actuales que está utilizando y los que planea usar en el futuro.

Fluorescencia combinada con microscopía confocal: en los sistemas confocales, la pérdida por una resolución de imagen mejorada al restringir la detección de luz viene dada por una reducción en el brillo de la muestra. Por lo tanto, con la microscopía confocal se emplean normalmente una o más etiquetas fluorescentes se para resaltar las estructuras de interés y mejorar el contraste dentro de una muestra. Incluso se puede lograr un mayor contraste y diferenciación cuando se usan múltiples etiquetas fluorescentes para diferentes estructuras.

Las soluciones de iluminación activa (AL) se pueden utilizar junto con técnicas de microscopía particulares, como la microscopía de fluorescencia. Los sistemas de disco giratorio y confocal de campo barrido (SFC) son ideales para la obtención de imágenes de eventos intracelulares de gran velocidad, como la dinámica de los iones de calcio.

Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM): TIRFM es una técnica altamente sensible que le permite realizar investigaciones funcionales en células vivas usando fluorescencia. Crea solamente imágenes de estructuras dentro de una capa muy delgada ya que usa la reflexión total interna para iluminar las células que entran en contacto con una superficie y solo produce una profundidad de excitación muy estrecha. Debido a que la iluminación está tan enfocada, TIRFM permite imágenes 2D de muy alta resolución, hasta menos de 200 nm. Esta no es una técnica de alto rendimiento, sino una para analizar pequeños eventos celulares muy específicos en la superficie. TIRFM es el método de elección para visualizar moléculas individuales en células vivas, en particular moléculas fluorescentes ubicadas en sitios de adhesión celular, membranas celulares y orgánulos citoplasmáticos proximales de membrana. Los sistemas de microscopía TIRF ahora están disponibles comercialmente en muchos proveedores de microscopios.

Imágenes de células vivas

En experimentos de cultivo celular convencionales, los protocolos implican tomar mediciones en un microscopio en marcas de tiempo específicas.
Este método no ofrece una imagen completa del comportamiento de la célula que, por lo demás, es dinámico y cambiante. Agregar un elemento "en vivo" a su microscopía puede elevar sustancialmente los datos que obtiene de sus experimentos y proporcionarle información sobre células que no se ven a través de métodos convencionales.

El enfoque de imágenes de células en vivo, junto con la microscopía de fluorescencia o confocal, puede producir imágenes, videos y datos que de otra manera podrían pasar desapercibidos en los enfoques convencionales. La microscopía con imágenes de células vivas ahora está recibiendo mucho empuje en muchas aplicaciones de las ciencias de la vida, incluida la cicatrización de heridas, la comunicación célula-célula, los estudios de señalización, los cultivos de células en 3D, la biología del desarrollo y vascular, entre otros.

El sistema de análisis de células en vivo IncuCyte S3® de Sartorius obtiene y analiza automáticamente las imágenes durante todo el día sin tener que retirar las células de la incubadora. Su función de “walkaway” le ayuda a capturar procesos fisiológicamente relevantes a medida que dedica su tiempo realizando otros experimentos. Sin desplazar las células o mover las placas de cultivo celular, puede recopilar imágenes durante el transcurso de su experimento, lo que le ofrece una "instantánea" del verdadero comportamiento fisiológico. Además, el software de análisis de imágenes lo ayuda a analizar la cinética, brindando información adicional a sus imágenes capturadas.

Ventajas de las imágenes de células vivas

• Está activo: permite el seguimiento en tiempo real de procesos celulares sutiles y cambios in vitro.
• Es detallado: ofrece un lapso de tiempo, comprensión detallada del comportamiento celular.
• Es automático: los experimentos continúan y los datos se recopilan incluso cuando no estás.
• Es minimalista: puede obtener múltiples puntos de datos de un lote de cultivo celular, por lo que puede sacar el máximo provecho de las células primarias sensibles y de bajo rendimiento.
• Está libre de contaminación: elimina el manejo de las placas de cultivo celular entre lecturas.

Consideraciones experimentales clave para imágenes de células vivas

En imágenes de células vivas, las principales consideraciones experimentales son:

1. la relación señal / ruido
2. la tasa de adquisición de imágenes
3. la viabilidad de la muestra.

Para capturar los procesos celulares en vivo, es importante asegurarse de que sus células tengan las condiciones ambientales adecuadas, como la temperatura y el CO2 / O2, para que permanezcan viables durante todo el período de tiempo de la toma de imágenes. Al configurar su protocolo de imágenes en vivo, se debe tener cuidado de espaciar las imágenes para evitar largos períodos de exposición a la luz que pueden ser fototóxicos para las células. Para aplicaciones de imágenes de células vivas, es deseable una iluminación de baja potencia.

Otros sistemas de imágenes de células vivas incluyen el BioTek Cytation ™ 5.

Microscopía electrónica

Los microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones acelerados para obtener imágenes de una muestra y ofrecen altos aumentos y resolución para revelar las complejidades de los orgánulos celulares.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) produce imágenes de alta calidad y detalle al pasar los electrones a través de una delgada sección de la muestra. Por ejemplo, se puede usar para ver los detalles de las mitocondrias en las células. TEM también puede proporcionar información sobre elementos y estructura compuesta.

Los microscopios electrónicos se pueden acoplar con equipos de imagen estándar, como CCD y EMCCD. La corrección por software de la aberración esférica en TEM ha permitido la producción de imágenes con resolución suficiente para mostrar los átomos de carbono en el diamante separados por solo 0.089 nm, y los átomos en silicio a 0.078 nm con magnificaciones de 50 millones de veces. La capacidad de determinar las posiciones de los átomos dentro de los materiales ha hecho del TEM una herramienta indispensable para la investigación y el desarrollo de la nanotecnología en muchos campos, incluida la catálisis heterogénea y el desarrollo de dispositivos semiconductores para electrónica y fotónica. Dentro de las ciencias de la vida, es principalmente la preparación de muestras la que limita la resolución de lo que podemos ver en el microscopio electrónico, en lugar del microscopio en sí.

La preparación de la muestra puede ser bastante costosa, con riesgos de introducir artefactos. CryoSEM evita la preparación compleja y puede ser útil cuando se estudian muestras que contienen agua / humedad, como productos botánicos y alimentos. Sin embargo, tiene limitaciones, como la contracción de la muestra. Considere las diferentes marcas, ya que cada una tiene un mecanismo diferente, con diferentes accesorios, complementos y ópticas.

Considere también la capacidad del microscopio para controlarse automáticamente mediante el software incorporado, en lugar del control manual de funciones como el zoom, que a menudo requiere un especialista.

Microscopía electrónica de barrido (SEM)

SEM produce imágenes en 3D que brindan información sobre detalles morfológicos y topográficos y la caracterización básica de la superficie, como el estudio de la superficie de polen de plantas, sistemas de tallos y raíces. Un sistema de haz de iones enfocado (FIB) es una herramienta que tiene un alto grado de precisión y se puede usar para revelar artefactos debajo de la superficie en materiales y dispositivos. Los sistemas DualBeam (FIB / SEM) son la solución preferida para microscopía 3D.

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

AFM es un método de escaneo que puede ver detalles a nivel de una fracción de un nanómetro. Utilizando una combinación de AFM y microscopía de radiación de sincrotrón, científicos en Italia han podido mapear elementos vitales en una sola célula cancerosa. Este enfoque multimodal proporciona concentración molar, densidad celular, masa y volumen de carbono, nitrógeno, oxígeno, sodio y magnesio.

Otros factoresa tener en cuenta para elegir un microscopio

Detectores de electrones

Las capacidades de un microscopio electrónico dependen de los detectores que alberga. La mayoría de los microscopios electrónicos pueden albergar una variedad de detectores. Por ejemplo, los detectores SEM están diseñados para detectar electrones secundarios que se emiten desde la superficie de la muestra como resultado de la excitación del haz primario. Si desea un microscopio electrónico de usos múltiples, asegúrese de que el detector sea adecuado para múltiples aplicaciones o que pueda cambiarse fácilmente según sea necesario.

Un rendimiento de baja tensión

¿Cómo funciona el rendimiento óptico electrónico del microscopio a bajos voltajes? Algunos microscopios electrónicos tienen una alta resolución con tan solo 1 kV. Sin embargo, la alta resolución a bajos voltajes puede no ser importante. Las imágenes sensibles a la superficie con alto contraste de material se garantizan mejor con voltajes de aceleración más bajos. La menor tensión evita la penetración del haz en la muestra.

Consideraciones de la sala de microscopio electrónico

El espacio de la sala y el entorno de la sala son factores importantes en la microscopía electrónica, especialmente para una TEM. Las consideraciones y requisitos de la sala son:

• Banco amortiguador de vibraciones
• Regulación de luces
• Acceso de alta tensión
• Blindaje electromagnético
• Control de movimiento de aire y limpieza, utilizando aire acondicionado y bombas de vacío
• Sala separada de preparación de muestras

A menudo, un ingeniero de la empresa realizará una visita al sitio para evaluar la idoneidad de una habitación.

Microscopía de luz y electrónica correlativa

Recientemente, ha habido un impulso para combinar las mejores partes de la microscopía óptica y electrónica; para obtener detalles a un nivel molecular amplio y combinarlos con los intrincados detalles intracelulares, para examinar todo el alcance de la biología subyacente. Tal combinación se conoce como microscopia correlativa.

Imagen y análisis

Cámaras de microscopio: la captura y el análisis de imágenes digitales ahora ha superado ampliamente los métodos de imágenes anteriores. Las cámaras digitales y productores de imágenes permiten al usuario tomar imágenes o videos de la sustancia o estructura que se analiza directamente desde el microscopio.

Cuantitativo versus cuantitativo: para la microscopía digital, es importante considerar qué datos desea obtener de su muestra. Si solo necesita imágenes cualitativas para la visualización, o imágenes más detalladas para la cuantificación, determinará las especificaciones de software e imaginología que necesita.

Software: el software de análisis de microscopios está disponible para muchos fabricantes y, de nuevo, variará según la aplicación. Compruebe que cualquier software que obtenga sea compatible con los instrumentos que está utilizando.

Tamaño y almacenamiento de imágenes: considere dónde publicará sus imágenes, si es que lo hace. ¿Se utilizarán en publicaciones o pósters de alta calidad? De lo contrario, ¿su laboratorio realmente requiere el gran tamaño de archivo y el detalle de imagen de las cámaras de alto rendimiento? La cantidad de megapíxeles en una cámara generalmente equivale a cuán grande puede ampliar la imagen sin perder calidad.

El costo es una consideración importante. Aunque no hemos cubierto los costos en este artículo, le aconsejamos que pregunte sobre funciones / equipos / software adicionales o el servicio / capacitación postventa.

Conclusiones

Hay muchos tipos diferentes de instrumentos de microscopía en el mercado.
Encontrar el correcto para su aplicación puede parecer desalentador, pero al aplicar algunas consideraciones simples, la selección de la herramienta de microscopía adecuada para su investigación puede ser una tarea más fácil.

Fuente: SelectSicence