La preparación de soluciones estándar de etanol es un paso de rutina en la cuantificación del contenido de alcohol de las bebidas mediante cromatografía de gases (GC); sin embargo, el pipeteo preciso de líquidos volátiles, como el etanol, puede ser un desafío. La preparación de estándares mediante el pipeteo ofrece ventajas en cuanto a costes y tiempo en comparación con los protocolos que implican el pesaje.
Puede ahorrar tiempo y dinero valiosos y evitar lavar cantidades excesivas de cristalería. El pipeteo preciso también puede acelerar el proceso de preparación. Puede omitir la dilución estándar interna por separado y reducir los volúmenes a < 1 ml al diluir las muestras finales de GC con el estándar interno. Aquí, mostramos que aplicar la técnica de pipeteo correcta al preparar estándares de etanol genera resultados reproducibles con GC.
Las soluciones estándar son la columna vertebral para realizar análisis precisos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases (GC). Las soluciones estándar, que contienen concentraciones conocidas de un analito, se utilizan para cuantificar un analito de concentración desconocida y deben prepararse de manera precisa para garantizar una medición exitosa.
La GC se usa comúnmente para cuantificar el contenido de etanol en bebidas alcohólicas, como el vino y la cerveza. La cuantificación de etanol con GC requiere una curva de calibración que se genera utilizando soluciones estándar de etanol, así como un estándar interno (ISTD), como el 1-butanol. Tanto el etanol como el 1-butanol son líquidos volátiles que son difíciles de pipetear con precisión. Esto puede solucionarse con pipetas de desplazamiento de aire siguiendo buenas prácticas de pipeteo y adaptándose a las características específicas de los líquidos volátiles.
Los líquidos volátiles se evaporan hasta alcanzar un equilibrio con el medio ambiente. Por lo tanto, humedecer previamente la punta de la pipeta con el líquido pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de dispensar equilibra el entorno dentro de la punta y mejora la precisión del pipeteo. El pipeteo inverso también es beneficioso cuando se trabaja con líquidos volátiles. En el pipeteo inverso, se aspira un exceso de líquido en la punta, pero solo se dispensa el volumen objetivo. Si se produce una mayor evaporación después de humedecer previamente la punta, se debe al exceso de volumen, lo que permite una dispensación reproducible del volumen objetivo.
En esta nota de aplicación, comparamos la precisión de preparar soluciones estándar y muestras para GC usando las pipetas Sartorius Tacta® y las puntas de pipeta Sartorius Optifit versus el método de referencia por pesaje.
Materiales y métodos para preparar estándares de GC y HPLC
Pipetas y puntas de pipeta
Las pipetas Sartorius TacTa® (0.1–10 μl, 10–100 μl, 100–1,000 μl, 500–5,000 μl, 1,000-10,000 μl) y las puntas de pipeta Optifit de Sartorius (10, 200, 1,000, 5,000 y 10,000 μl) se usaron para la preparación de soluciones estándar de etanol, ISTD y muestras.
Agua
Se utilizó agua tipo 2 de un Sartorius Arium® Advance equipado con un Arium® Bagtank 20.
Preparación de Soluciones Estándar de Etanol
Se utilizó etanol absoluto (Altia ETAX Aa, 99,5% V/V) para la preparación de soluciones estándar de etanol. Se prepararon cinco soluciones estándar para cubrir el rango esperado de concentración de etanol en las muestras (aproximadamente 0,5–7 % V/V). Las concentraciones de las soluciones estándar fueron: 0,53%, 0,95%, 2,00%, 5,03% y 7,17%. Para lograr estas concentraciones respectivas, 53 μL, 95 μL, 201 μL,
506 μL, y 721 μL se pipetearon con pipetas Tacta® 10-100 μL o Tacta® 100–1,000 μL en matraces volumétricos de 10 mL (Tabla 1). Al preparar las soluciones estándar de acuerdo con el método de referencia (Tabla 1), pesamos etanol en cantidades de 0,042 g, 0,0752 g, 0,159 g, 0,399 g y
0,569 g con una balanza Sartorius Cubis®. El método de referencia se describe en el Método 9.2.4 de Analytica-European Brewery Convention (EBC).
Tabla 1
Métodos para preparar las soluciones estándar de etanol
| Método | Descripción |
| Referencia (descrito en Analytica-EBC, Método 9.2.4) | Pesar la cantidad adecuada de etanol absoluto en un matraz aforado de 10 mL y enrasar con agua. Anote el peso exacto de etanol tomado para la preparación de cada estándar. Los estándares de etanol deben almacenarse en botellas de vidrio selladas a 0–4 °C. |
| A | Pipetee 5 ml de agua en un matraz volumétrico de 10 ml. Utilice una pipeta Tacta® de 10–100 μL y 100–1000 μL para pipetear el etanol. Sin humedecer previamente la punta, pipetee etanol en el matraz y haga la marca con agua. |
| B | Pipetee 5 ml de agua en un matraz volumétrico de 10 ml. Utilice una pipeta Tacta® de 10–100 μL y 100–1000 μL para pipetear el etanol. Humedezca previamente la punta 10 veces, pipetee el etanol al revés en el matraz y haga la marca con agua. |
| C | Pipetee 5 ml de agua en un matraz volumétrico de 10 ml. Humedezca previamente la punta 10 veces, pipetee el etanol al revés en el matraz y haga la marca con agua. En comparación con el Método B, use solo una pipeta Tacta® de 100–1000 μL para pipetear etanol al preparar las cinco soluciones estándar. |
Nota. Los pasos de pipeteo se llevaron a cabo con pipetas Tacta® de 10–100 μL, 100–1000 μL o 500–5000 μL.
Preparación de muestras de bebidas
Se eliminó el exceso de dióxido de carbono de 200 mL de muestras de bebidas carbonatadas (cerveza y vino espumoso) mediante incubación durante 10 min en un baño ultrasónico (Branson 2510).
Las muestras de cerveza se filtraron como se describe en Analytica-EBC, Método 9.2.4. Las bebidas alcohólicas se diluyeron pipeteando con pipetas Tacta® de 500–5000 μL y 1000–10 000 μL como se describe en la Tabla 2.
Tabla 2
Bebidas que fueron analizadas
| Muestra Nro. | Tipo | Contenido de etanol informado en botella, % (V/V) | Dilución en agua tipo 2 por Sartorius Arium® |
| 1 | Cerveza sin alcohol | 0.5 | Sin dilución |
| 2 | Cerveza de trigo | 6.6 | 1:1 (5 mL de muestra + 5 mL de agua) |
| 3 | Cerveza de trigo | 7 | 1:1 (5 mL de muestra + 5 mL de agua) |
| 4 | vino blanco espumoso | 11 | 1:1 (5 mL de muestra + 5 mL de agua) |
| 5 | Vino tinto sin alcohol | 0.5 | Sin dilución |
| 6 | Vino tinto | 14 | 1:3 (3 mL de muestra + 6 mL de agua) |
| 7 | Espirituosa | 40 | 1:10 (1 mL de muestra + 9 mL de agua) |
Elaboración de Norma Interna
Se usó 1-butanol (reactivo analítico, Riedel-de Haën) como ISTD. Similar al etanol, el 1-butanol es un líquido volátil. El ISTD se preparó de dos maneras diferentes: como se describe en Analytica-EBC, Método 9.2.4 (preparación de una solución de 1-butanol al 0,5 %) o pipeteando 1-butanol directamente en el vial de GC con un Tacta® 0,1–10 μL pipeta (Tabla 3, Método 2). El Analytica-EBC, Método 9.2.4 se realizó de la siguiente manera: pipetear 10 mL de 1-butanol a 20 ± 0,1 °C en un matraz volumétrico de dos litros y diluir a volumen con agua a 20 ± 0,1° C. Añadir el tapón y agitar bien.
Instrumento y método de GC
Las muestras finales se prepararon como se describe en la Tabla 3. La concentración final de ISTD en las muestras fue de 0,45% V/V. Las muestras (1 μL) se inyectaron en el GC (6890N, Agilent Technologies) con una columna Agilent J&W DB-1701 (Cat. No. 122-0732, 30 m x 0,25 mm, 0,25 μm). Se prepararon muestras duplicadas y cada muestra se analizó dos veces.
Tabla 3
Preparación de las muestras finales de GC
| Método | Descripción |
| Referencia (descrito en Analytica-EBC, Método 9.2.4) | Diluya 2 ml de cada solución estándar de etanol o muestra con 20 ml de ISTD al 0,5 % pipeteando en un matraz cónico de 50 ml limpio y seco. Asegúrese de que ambas soluciones se mantengan a 20 ± 0,1 °C antes de diluirlas. La precisión de la temperatura en esta etapa es fundamental para la precisión del método. Agregue el tapón y mezcle bien. Pipetee 1 ml en viales de GC. |
| 1 | Pipetee 909 μL de ISTD al 0,5 % (preparado según Analytica-EBC, Método 9.2.4) y 91 μL de muestra o solución estándar de etanol directamente en el vial de GC. |
| 2 | Pipetee 904,5 μL de agua, 91 μL de muestra o solución estándar de etanol y 4,5 μL de 1-butanol directamente en el vial de GC. Humedezca previamente la punta 10 veces y pipetee a la inversa cuando pipetee el 1-butanol. |
Resultados y discusión
Las curvas de calibración de etanol se muestran en la Figura 1. La curva de calibración generada a partir de estándares preparados de acuerdo con el Método B (sigue las mejores prácticas de pipeteo, incluido el prehumedecimiento y el uso de la técnica de pipeteo inverso) fue comparable a la curva de calibración generada a partir de los estándares preparados de acuerdo con el método de referencia. La curva generada a partir de estándares preparados de acuerdo con el Método A (sin humedecer previamente la punta de la pipeta y utilizando la técnica de pipeteo directo) mostró poca similitud con el método de referencia. Método C Fue igual que el método B, excepto que solo se usó una pipeta (pipeta Tacta® de 100–1000 μL) para pipetear etanol (53 μL, 95 μL, 201 μL, 506 μL y 721 μL) al preparar las soluciones estándar. Esta curva de calibración también mostró poca similitud con el método de referencia. Recomendamos utilizar una pipeta que tenga un volumen nominal lo más cercano posible al volumen que pretende pipetear. Además, el rango de volumen de la pipeta debe cubrir el volumen que desea pipetear.
Figura 2
Reproducibilidad en GC con Método de Referencia y Método 2
Nota. Pipetear el estándar interno (1-butanol) directamente en el vial de muestra de GC produjo picos reproducibles en GC. Se muestran los picos superpuestos de diez muestras diferentes. Cinco de estas muestras se prepararon de acuerdo con el método de referencia y las otras cinco muestras se prepararon de acuerdo con el Método 2 (Tabla 3). Los diez picos se eluyen conjuntamente y muestran áreas similares bajo la curva.
En resumen, la aplicación del Método B para preparar soluciones estándar de etanol y el Método 2 para preparar la muestra final de GC reduce el tiempo de preparación de la muestra de aproximadamente 35 minutos a 18 minutos (Figura 3). Además, la combinación del Método B y el Método 2 reduce al mínimo la cantidad de material de vidrio necesario, ya que no es necesario preparar una solución ISTD al 0,5% por separado y diluir las muestras y los estándares con esta solución ISTD antes de preparar las muestras reales de GC. Además, los volúmenes de trabajo también son más bajos en el Método 2 en comparación con el método de referencia.
Figura 3
Comparación del tiempo de preparación de muestras
Nota. La aplicación del Método B para preparar estándares de etanol en combinación con el Método 2 para la preparación final de muestras de GC redujo el tiempo de preparación de muestras en un 50 % en comparación con el método de referencia.
Las muestras de bebidas se analizaron con GC y se determinaron sus contenidos de etanol (Tabla 4). Los contenidos de etanol determinados experimentalmente estaban cerca de los contenidos de etanol informados en las botellas. La solución estándar de etanol con la concentración de etanol más baja fue 0,53 % V/V, que es superior a la concentración de etanol informada de las bebidas no alcohólicas (Muestras 1 y 5). Por lo tanto, es probable que los resultados de estas muestras no muy precisos, ya que están fuera del rango de calibración. Recomendamos preparar soluciones estándar que abarquen todo el rango de concentración; incluidas las soluciones estándar que están por debajo de la muestra con la concentración de etanol esperada más baja y por encima de la muestra con la concentración de etanol esperada más alta. En este trabajo, preparamos cinco soluciones estándar. También puede aumentar el número de soluciones estándar para aumentar la precisión.
| Muestra Nro. | Tipo de Bebida | Contenido de etanol informado en botella, % (V/V) | Contenido de etanol determinado experimentalmente % (V/V) | Diferencia relativa (%) |
| 1 | Cerveza sin alcohol | 0.5 | 0.21 | 58 |
| 2 | Cerveza de trigo | 6.6 | 6.52 | 1.2 |
| 3 | Cerveza de trigo | 7 | 6 | 14 |
| 4 | Vino blanco espumoso | 11 | 10.58 | 4 |
| 5 | Vino tinto sin alcohol | 0.5 | 0.21 | 58 |
| 6 | Vino tinto | 14 | 13.68 | 2.3 |
| 7 | Espirituosa | 40 | 38.65 | 3.4 |
Nota. Las bebidas alcohólicas y no alcohólicas se analizaron con GC y el contenido de etanol se determinó mediante la curva de calibración preparada según el método de referencia (Cuadro 1). Las muestras se prepararon según el Método 1 (Tabla 3).
Conclusiones
En este trabajo, aplicamos las mejores prácticas de pipeteo para la preparación simple y precisa de soluciones estándar de etanol y el estándar interno para la semicuantificación de etanol en bebidas por GC. El pipeteo inverso, que se recomienda para pipetear líquidos volátiles, permitió un pipeteo confiable de etanol y butanol en este estudio. Es importante destacar que el pipeteo ayuda a mejorar los flujos de trabajo al ahorrar tiempo durante la toma de muestras.
preparación y limpieza.
Fuente: Sartorius
