El cultivo de células es una herramienta fundamental dentro de las ciencias de la vida, y desempeña un papel fundamental para responder preguntas científicas básicas y de investigación de traducción en todas las disciplinas. Mantener cultivos saludables es vital para obtener datos confiables y de alta calidad.
El cultivo de células es un trabajo duro. Debido a que es un proceso altamente técnico, hay muchas cosas que pueden salir mal cuando tomas células de una fuente y las manipulas en otra, desde la contaminación hasta el crecimiento mediocre.
Pero también hay muchas cosas que pueden salir bien. En los últimos más de 100 años, los experimentos de cultivo de células adherentes han contribuido a algunos de los avances más revolucionarios de la medicina moderna, mejorando nuestra comprensión de enfermedades como el cáncer y apoyando el desarrollo de tratamientos seguros y efectivos.
Afortunadamente, ahora se sabe mucho más sobre el cultivo que cuando el pionero in vitro, Ross Harrison, analizó tejido de rana en un portaobjetos de vidrio a principios del siglo XX. En esta guía, compartimos los conceptos básicos aprendidos durante más de un siglo de jugar con células vivas, incluido cómo sembrar, expandir y cosechar cultivos celulares.
Siembra celular desde un estado criogénico
En la compra de líneas de cultivo celular, los productos vienen criopreservados, lo cual es necesario para mantener la viabilidad celular a largo plazo. A partir de ese estado, deberá descongelar y sembrar las células, lo cual no debe apresurarse, aunque suceda rápido. Y, sin embargo, este paso importante a menudo se apresura y, a veces, se pasa por alto, lo que corre el riesgo de contaminación y no le da a las células el buen comienzo estéril que necesitan.
Esta es la forma correcta de realizar el proceso de siembra de células:
- Prepara todos tus suministros. Necesitarás el vial crioconservado, un vaso de precipitados o un baño de agua lleno de agua precalentada y un matraz con medios preequilibrados. También necesitarás un vial cónico lleno de medios de cultivo si tienes la intención de reducir la velocidad de las células y eliminar el DSMO u otro crioprotector.
- Caliente el vial. Agitar suavemente el vial crioconservado en el vaso de precipitados con agua precalentada hasta que el contenido se descongele casi por completo. Luego, limpiar el vial con una toallita con alcohol para reducir el riesgo de contaminación.
- Siembra tus células. Con una pipeta, retira las células del criovial y transfiérelas al matraz. Luego, pipetea el contenido del matraz hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución y facilitar la siembra. Con eso, tus células se descongelan, transfieren y están listas para la incubadora (o la centrífuga para la eliminación de DSMO).
Ampliación con expansión celular
Cuando llegue el momento de escalar sus celdas, necesitarás el enfoque correcto de expansión de celdas. La expansión celular es una parte necesaria del cultivo celular que se basa tanto en la eficiencia como en la consistencia. Si sigues un flujo de trabajo ineficiente, probablemente aumentarás los costos de suministros y mano de obra. Si sigues un flujo de trabajo inconsistente, podrías sobrecargar tus células y matarlas.
Lograr el equilibrio adecuado dependerá de la elección del recipiente. Las opciones multicapa, como los Corning, pueden ayudar a los científicos de la vida a establecer condiciones amigables para un crecimiento más rápido en un espacio más pequeño, y también con menos mano de obra y riesgo de contaminación.
Debido a que no todos los recipientes tienen la misma área de crecimiento, los investigadores generalmente pensarán en términos de rendimiento de células/cm2 cuando determinen la elección de su recipiente y la cantidad de reactivos asociados. Luego usarán esto para evolucionar constantemente su tren de semillas en la cantidad de células que necesita el investigador. Para un crecimiento óptimo, mantenga la misma proporción de células/cm2 y ml/cm2 en todos los recipientes y reactivos haciendo lo siguiente:
- Aplica esta fórmula para calcular tus células por vaso: [(células/cm2 deseadas)*(cm2 del vaso)].
- Aplique esta fórmula para calcular su medio por recipiente: [(mls/cm2 deseados)*(cm2 del recipiente)]. Para un crecimiento celular y una difusión de gas óptimos, la mayoría de las aplicaciones requerirán entre 0,2 ml y 0,5 ml de medio por cm2.
Recolección de las células adherentes
Sabrás que las células están listas para cosechar cuando aparezcan como una monocapa en todo el cultivo bajo el microscopio. En ese momento, los científicos generalmente eliminarán las células por medios químicos o físicos.
La eliminación química a través de reactivos de disociación debe optimizarse para el tipo de célula y la aplicación a fin de garantizar que el reactivo no afecte negativamente a las células. Por el contrario, la eliminación física a través de raspadores de células puede ser mejor para células sensibles y fuertemente adherentes que podrían no tolerar los reactivos de disociación. Considere también su aplicación posterior y cómo o si el reactivo de disociación puede afectar sus estudios.
Si elige utilizar reactivos de disociación, siga este proceso asépticamente con una pipeta:
- Retire los medios del matraz.
- Agrega una solución tampón como PBS al matraz para eliminar cualquier rastro de suero que pueda interferir con el agente de disociación. Mueva suavemente el recipiente para igualar la solución en el interior. Remoje durante 10 a 15 minutos para líneas celulares difíciles de separar. Retire la solución tampón.
- Agrega el reactivo de disociación a 0,02 a 0,03 mL/cm2. Según la línea celular o el reactivo de disociación, es posible que desee incubar el recipiente a 37 °C para promover la disociación.
- Las celdas están listas cuando parecen redondeadas pero aún no agrupadas, casi como si estuvieras mirando un cielo nocturno lleno de miles de estrellas. La turbidez del líquido es una buena señal de que se han desprendido y están listos.
- Diluye el reactivo de disociación, normalmente en una proporción de 1:1, ya sea con la solución tampón o con el suero que contiene el medio. Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de retirar toda la solución y transferirla al tubo.
- Concluye con la centrifugación si las células son especialmente sensibles al reactivo. Ahora sus células están listas para contar, para que pueda medir la densidad y viabilidad celular.
Cómo hacer que el cultivo celular funcione para vos
Los cultivos de células adherentes pueden abrir tu laboratorio a un mundo completamente nuevo de experimentación y aplicaciones posteriores, y también puede ser divertido. Pero puede haber mucho en juego cuando se manipulan células vivas, por lo que es importante hacerlo correctamente. Si sigues estos consejos esenciales y progresas hacia protocolos más avanzados, puede convertirse en un profesional del cultivo celular en muy poco tiempo. Además, familiarizarse con el manejo adecuado de la placa de Petri es fundamental para garantizar el éxito y la salud de tus cultivos.
Fuente: Corning. Guide to Adherent Cell Culture Basics: Seeding, Expanding, and Harvesting
