La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR, RT-PCR) comparten muchas similitudes, pero funcionan de manera diferente y generan productos finales divergentes que hay que tener en cuenta a la hora de adquirir tecnología PCR o qPCR.
Mientras que la PCR simplemente amplifica el ADN mediante una secuencia de pasos clave, la qPCR detecta y cuantifica el producto en tiempo real a medida que se amplifica, de ahí las designaciones "RT" y "q". Las curvas de amplificación de qPCR generadas a partir de la detección de fluorescencia proporcionan una medida precisa de con cuánto material comenzó el analista. Por el contrario, los resultados de la PCR convencional o de "punto final" generalmente se visualizan mediante electroforesis en gel y, por lo tanto, brindan, en el mejor de los casos, mediciones semicuantitativas mediante el uso de estándares de gel hasta la secuenciación o análisis posteriores por otros medios.
Al final de la PCR tradicional, normalmente tendrá una banda brillante en el gel, independientemente de la cantidad de material con el que empezó. Con qPCR, los estándares se utilizan para determinar cuál fue la cantidad inicial en una escala de muchos órdenes de magnitud.
La curva de amplificación es el principal indicador de que una qPCR se ha desarrollado satisfactoriamente (o no). Se genera excitando las etiquetas de fluorescencia y cuantificando la respuesta mediante la aplicación de un algoritmo de software para generar una curva cuya forma es diagnóstica.
Dado que se basa en la detección por fluorescencia, la qPCR es capaz de detectar múltiples dianas genéticas en la misma reacción o muestra y puede cuantificar sus proporciones. Una aplicación útil de esta capacidad es la determinación de elementos genéticos masculinos/femeninos o humanos/no humanos.
qPCR: Solución de problemas generales
En qPCR, la baja eficiencia de amplificación puede ser un problema importante. Un gran número de factores, de fuentes divergentes, contribuyen a la eficiencia. Los problemas relacionados con el protocolo surgen de la configuración de la reacción, el diseño de los cebadores y los pasos del ciclo, la cantidad de polimerasa utilizada y la concentración de cloruro de magnesio. La calidad de la muestra, la matriz y el método de aislamiento también contribuyen.
Estos factores comúnmente resultan en ruido o curvas de amplificación retrasadas. Los retrasos generalmente indican una concentración de objetivo baja, pero pueden deberse a una eficiencia de amplificación deficiente. El ruido es algo más complejo, ya que puede surgir de la amplificación de objetivos no deseados debido a un diseño deficiente del cebador, ciclos de temperatura subóptimos u otros factores.
Las curvas de amplificación retardada no siempre son malas, pero es preferible lograr una amplificación sólida donde se obtienen curvas sólidas a partir de una cantidad mínima de ADN objetivo.
La resolución de problemas de qPCR implica probar condiciones y componentes que se sabe que afectan la eficiencia de la PCR. Estos incluyen temperaturas de recocido, cloruro de magnesio y concentraciones de imprimador, entre otros. Los operadores casi siempre pueden resolver estos problemas y la experimentación generalmente no requiere recursos prohibitivos.
Trabajar en una placa qPCR de 96 pocillos permite a los investigadores probar varios factores simultáneamente.
En lugar de utilizar un lector de placas, el experimento de resolución de problemas se realiza dentro del instrumento qPCR, que proporciona incubación, ciclos de temperatura y medición de fluorescencia. Dependiendo de la profundidad de un parámetro de problema en particular, las pruebas demoran desde unas pocas horas hasta varios días.
Los laboratorios que trabajan en un nuevo experimento de qPCR suelen comenzar con una mezcla maestra que incluye todos los reactivos necesarios para realizar la amplificación genética. Hay numerosas mezclas maestras disponibles comercialmente, adecuadas para cualquier objetivo genético y tipo de muestra imaginables. Si los resultados no son los esperados o no logra una amplificación satisfactoria utilizando una mezcla maestra, comience un ejercicio de optimización.
Cuidar el Procedimiento Operativo Estándar
Dependiendo de los cebadores, los reactivos y el objetivo, las PCR pueden ser más o menos sensibles a las condiciones de reacción, como las concentraciones de sal y magnesio, o el arrastre de etanol de la preparación de la muestra. Los laboratorios que utilizan métodos caseros de preparación de ADN pueden observar variabilidad entre los tubos o pocillos al realizar la PCR. Los errores también pueden aumentar a medida que disminuye el rigor del protocolo, especialmente en reacciones multiplexadas que apuntan a amplificar más de un objetivo.
Los expertos aconsejan a los analistas que instituyan prácticas de laboratorio más rigurosas, especialmente en lo que respecta a la preparación de muestras, y que piensen en la coherencia. Una técnica de laboratorio descuidada a veces puede ocultar fuentes secundarias de variabilidad.
Para los laboratorios acostumbrados a fabricar sus propios reactivos, la resolución de problemas puede ser tan simple como comprar reactivos formulados según estrictos estándares de concentración. Los proveedores de insumos para laboratorios brindan coherencia desde el principio. Prueban sus productos, por lo que los consumidores no necesitan preocuparse por las inconsistencias de los reactivos que afectan sus reacciones.
La PCR ha avanzado hasta el punto en que los proveedores ahora ofrecen kits de reactivos que contienen tampones y enzimas que son menos sensibles a las condiciones de reacción, por ejemplo, concentraciones de magnesio o etanol. Sin embargo, los usuarios aún deben tener cuidado al ejecutar PCR con estos kits.
La PCR es sensible a los contaminantes, por lo que los operadores deben usar guantes, agua de calidad PCR y material de vidrio super limpio y trabajar dentro de un área limpia. Los contaminantes ambientales (ácidos, bases, iones) pueden afectar la PCR mediante la inhibición de las enzimas polimerasas, lo que resulta en una amplificación menos vigorosa (o curvas “más lentas” para qPCR). Nuevamente, algunos kits de reactivos están diseñados para ser menos sensibles a los efectos de la contaminación.
Depuración avanzada
Un problema avanzado común involucra cebadores diseñados de manera subóptima. Los cebadores que no son únicos o que no se unen fuertemente al gen objetivo reconocerán y amplificarán secuencias similares, lo que disminuirá la eficiencia de la reacción y agregarán un fondo.
El sesgo de amplificación genera problemas en la PCR multiplex. Una forma en que surge el sesgo es cuando el par de cebadores para la secuencia A es 100 por ciento eficiente pero la eficiencia del par de cebadores para la secuencia B es sólo del 80 por ciento. Dado que la PCR es una operación logarítmica, la secuencia A no tardará mucho en eliminar la señal de la secuencia B. Entonces, parecerá que hay más gen A que gen B en la muestra. Este efecto ocurre tanto en qPCR como en PCR tradicional.
Los operadores pueden superar el sesgo de amplificación rediseñando sus cebadores para lograr una selectividad de objetivo óptima. Ejecutar cada amplificación individualmente arrojará algo de luz sobre posibles desajustes de eficiencia. Si el sesgo no se puede superar utilizando diferentes cebadores o mediante ajustes del protocolo, simplemente comprender la naturaleza y el alcance del sesgo puede ser suficiente.
Los cebadores son uno de los componentes más importantes de la PCR. Si tiene cebadores bien diseñados, otras fuentes de error se vuelven menos prominentes.
Autor: Ángelo DePalma, PhD
Fuente: LabManager. Optimizing and Troubleshooting PCR
