Según los experimentos realizados, se pudo demostrar que el agua ultrapura Arium® Mini Plus es excelente para su uso en cromatografía y espectrometría de masas (MS). En vista de los picos potencialmente coeluyentes y la señal de fondo en la detección UV y MS, se observó que el agua Arium® Mini Plus es comparable con los grados de calidad probados del agua embotellada disponible comercialmente.
Resultados de experimentos que compararon el agua ultrapura con el agua embotellada comercialmente.
Beneficios adicionales de los sistemas de agua:
Evitar que el agua permanezca en botellas abiertas durante períodos prolongados porque dicha agua almacenada en botellas abiertas puede contaminarse por absorción de la atmósfera del laboratorio y disolver el CO2 del aire, entre otros contaminantes.
Los contaminantes orgánicos en el agua son detectables mediante un aumento en el nivel de TOC (carbono orgánico total). En niveles altos de TOC, la identificación y cuantificación de los componentes traza puede verse comprometida [1], por ejemplo, por cambios en la línea base [1,2] o por la aparición de picos fantasma [3]. Además, si el agua embotellada se almacena durante períodos relativamente largos, los cationes Na, por ejemplo, pueden filtrarse de las botellas de vidrio, lo que, a su vez, puede conducir a una mayor formación de aductos durante la ionización en los sistemas LC-MS. Un rendimiento correspondientemente menor de iones utilizados para la evaluación (generalmente iones [M+H]+ o [M-H]-) puede tener un impacto negativo en la sensibilidad del método [4].
La alta idoneidad del agua dulce ultrapura, producida por los sistemas Arium® Pro, en diferentes técnicas de cromatografía (ver también, por ejemplo, 4 y 5) y el uso cada vez mayor de estas tecnologías en las más diversas aplicaciones muy probablemente contribuirán a la creciente aceptación y omnipresencia de los sistemas de purificación de agua de laboratorio.
Agua ultrapura para análisis HPLC - El papel del agua ultrapura
HPLC es un procedimiento analítico para la separación, identificación y cuantificación de sustancias mediante cromatografía líquida. Los inicios de la HPLC – Cromatografía Líquida de Alta Presión – se remontan a los años 60.
Gracias a la mejora de los materiales y equipos de las columnas, desde finales de los años 70 se la conoce como cromatografía líquida de alto rendimiento.1
En HPLC, la mezcla a separar se transfiere a una columna con un disolvente (agente eluyente) o con una mezcla de disolventes (eluyente|fase móvil), mediante un inyector y una bomba. La columna es un tubo, en la mayoría de los casos de acero inoxidable, lleno de la llamada fase estacionaria (ver también Fig. 1). La fase estacionaria suele consistir en gel de sílice poroso o partículas de polímero con ligandos químicos unidos en su superficie. Estos ligandos son responsables de las interacciones selectivas entre los
analitos y la fase estacionaria, que son necesarios para una separación cromatográfica eficaz. Dependiendo de la muestra y de la fase estacionaria, los mecanismos de separación implicados son, por ejemplo, adsorción por fuerzas de Van der Waals, intercambio iónico, exclusión iónica, etc.
Las sustancias de una muestra se retienen en el material de relleno de la columna durante diferentes períodos de tiempo y, por lo tanto, salen de la columna después de diferentes tiempos de retención. A continuación, un detector registra los componentes individuales de la muestra y los evalúa un ordenador.
El resultado es un cromatograma (Fig. 1, 5, 6). El número de picos corresponde al número de componentes separados en la muestra y el área es proporcional a la concentración de estos componentes separados (según Kromidas 20001).
Entre las aplicaciones típicas de HPLC se encuentra el análisis de azúcar.
Esto se realizó en el marco de diversas pruebas realizadas para caracterizar la calidad de las membranas. Por un lado, se comprobó la capacidad de las membranas para eliminar moléculas de azúcar y, por otro lado, se determinó la actividad de las membranas inmovilizadas con enzimas. Para ello se utilizan azúcares como rafinosa, glucosa y fructosa. Estos tipos de azúcar se pueden detectar específicamente mediante métodos enzimáticos como el ensayo GOD|POD para glucosa2 o métodos espectroscópicos, como la determinación de fructosa según Dische & Borenfreund.3
En el análisis avanzado, el azúcar ahora se analiza con frecuencia mediante cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Estos métodos se utilizan especialmente cuando se deben separar mezclas que contienen varios tipos de azúcar.5
En HPLC como se describe aquí, el eluyente debe tener especialmente alta pureza física y química, y no puede contener partículas mecánicas en suspensión ni sustancias disueltas que puedan ser liberadas por la columna con retardo y generar así una señal. La calidad de un disolvente suele ser decisiva para la fiabilidad de un análisis de HPLC. La presencia de trazas de contaminantes durante la elución en gradiente puede dar como resultado “picos fantasma o fantasmas”. Estas sustancias traza se acumulan en la columna durante un análisis y se liberan cada vez más cuando se cambia posteriormente el agente eluyente. El agua utilizada como eluyente debe estar libre de microorganismos. Para ello se utilizan sustancias que impiden el crecimiento de microbios y algas en la mezcla de disolventes, como sales de cobre o azida de sodio.5 Al hacerlo, se deben seguir las recomendaciones del fabricante de la columna, ya que el uso de aditivos incorrectos puede provocar daños irreversibles a la columna.
El agua desionizada o destilada todavía contiene cantidades considerables de sustancias orgánicas, que pueden provocar picos fantasma.5 Los disolventes contaminados pueden provocar la acumulación de depósitos en la fase estacionaria y, por tanto, provocar el bloqueo de la columna, que se manifestaría por un aumento de la presión y un cambio en el tiempo de ejecución para las muestras.
Empleo de Arium® Pro VF para purificar agua y utilizarla como eluyente
El agua de la calidad especial requerida para HPLC se puede comprar de varios fabricantes o producirse directamente en el sitio para su uso según demanda mediante el empleo de un sistema de purificación de agua, como el sistema Arium® Pro VF. A continuación se describen las pruebas realizadas para la separación de mezclas de azúcares en las que se utilizó como fase móvil (eluyente) agua ultrapura producida por Arium® Pro VF.
Descripción del sistema de agua ultrapura Arium® Pro VF
El sistema Arium® Pro VF (Fig. 2) ha sido diseñado para producir agua ultrapura a partir de agua potable pretratada eliminando los contaminantes que todavía están presentes en esta alimentación de agua potable. La producción de agua ultrapura requiere una recirculación continua y un caudal de agua constante, lo que se logra mediante un sistema de bomba incorporado con presión controlada. La conductividad del agua se mide en la entrada del agua de alimentación y directamente en el puerto aguas abajo (salida del agua producto). El sistema Arium® Pro VF utilizado en los estudios descritos en este artículo (un modelo predecesor con las mismas especificaciones técnicas que el sistema actualmente rediseñado que se muestra en la página siguiente) funciona con dos cartuchos diferentes. Estos están llenos de un adsorbedor especial de carbón activo y resinas de intercambio iónico de lecho mixto para suministrar agua ultrapura con un bajo contenido de TOC. Además, el sistema cuenta con una lámpara UV integrada que tiene un efecto oxidante en longitudes de onda de 185|254 nm. Además, el sistema de agua ultrapura Arium® Pro VF tiene un módulo de ultrafiltro incorporado que se utiliza como filtro de flujo cruzado. La membrana ultrafiltrante incorporada en este filtro retiene coloides, microorganismos, endotoxinas, ARN y ADN. Un filtro final de 0,2 µm instalado en la salida de agua sirve para eliminar partículas y bacterias durante el suministro del agua ultrapura producida. El proceso que emplea la unidad para purificar el agua se muestra en la Figura 3 (diagrama de flujo de Arium® Pro VF).
Figura 1
Materiales y método
Las muestras se analizaron utilizando un sistema HPLC Agilent Serie 1200 (Fig. 4 y Tabla 1) con un analizador de carbohidratos Rezex RNM Na+.
Columna de HPLC al 8% suministrada por Phenomenex.6
Esta columna está llena de un copolímero de poliestirenodivinilbenceno reticulado modificado por grupos sulfonato de sodio y utiliza un mecanismo de exclusión de iones. Esto significa que los analitos se separan en función de diferentes interacciones iónicas. Debido a los grupos sulfonato en la superficie de este material de relleno de columna, los poros tienen una carga negativa. Como resultado, las moléculas cargadas negativamente no pueden penetrar en los poros del material, lo que hace que eluyan antes. Este mecanismo de exclusión de iones se basa en el equilibrio de Gibbs-Donnan que gobierna el comportamiento de los iones cerca de una membrana. Los analitos que pueden penetrar en los poros de la membrana se separan posteriormente en función de diferencias estéricas, así como de interacciones hidrofóbicas y polares con los grupos funcionales en la superficie de la fase estacionaria. Para obtener más detalles sobre este mecanismo de separación, consulte 7.
Los tiempos de retención de varios tipos de azúcar están determinados por la absorbancia de la señal del índice de refracción (RI). Esta señal RI se expresa como un número adimensional en nanounidades de índice de refracción (nRIU) e indica la diferencia entre el índice de refracción de la muestra en la celda de muestra y la fase móvil en la celda de referencia.
Como fase móvil se utilizó agua ultrapura producida por el sistema Arium® Pro VF. Para desgasificar el eluyente en el sistema HPLC, esta agua ultrapura se filtró al vacío a través de una unidad desechable Sartolab BT 500 Bottle Top equipada con una membrana de 0,2 µm (Sartorius Sartolab BT 180C5).
Figura 2 | Tabla 1
Figura 3
Procedimiento para el análisis HPLC
Para preparar las series analíticas, la columna Rezex se calentó a 75 °C en el compartimento de la columna (calentador) y se lavó durante la noche con agua ultrapura Arium® Pro VF a 0,6 ml/min. La unidad óptica del detector RI se calentó a 35°C. Las muestras a analizar se prepararon utilizando agua ultrapura Arium® Pro VF y se filtraron previamente a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,2 µm (Sartorius Minisart® RC4, no. 17822). Las muestras se analizaron mediante HPLC según los parámetros definidos por un método de HPLC6 (Tabla 2).
Resultados
Para determinar los tiempos de retención de los tipos individuales de azúcar (Tabla 3), estos se prepararon e inyectaron individualmente (Fig. 5). A medida que diferentes azúcares interactúan con la fase estacionaria en distintos grados, el detector RI registra tiempos de retención específicos una vez que cada azúcar se ha movido a través de la columna. Una vez determinados los distintos tipos de azúcar, se preparó y separó una mezcla de azúcar (fig. 5).
Los componentes individuales del azúcar se separaron entre sí. Los picos para los diferentes tiempos de retención podrían asignarse a las muestras de azúcar individuales analizadas. El efecto de los contaminantes, o la influencia de las sales, se simuló inyectando tampón de fosfato de potasio y agua del grifo (Fig. 6).
La inyección de agua del grifo con una conductividad de 265 µS/cm y de tampón de fosfato de potasio con una conductividad de 1.700 µS/cm mostró señales claras y, por lo tanto, puede identificarse claramente como contaminación.
Los iones con carga múltiple son especialmente propensos a unirse con grupos sulfonato. Esto altera el equilibrio de disociación y puede afectar el tiempo de retención de un azúcar en particular. Por este motivo, la fase móvil debe estar libre de sales y otros contaminantes para poder realizar un análisis HPLC confiable con tiempos de retención estables y evitar picos fantasma. El agua ultrapura Arium® utilizada en este análisis tiene una conductividad de 0,055 µS/cm y está en gran medida libre de contaminantes que interfieren, lo que se expresa como una línea base plana sin picos (consulte la línea base verde en la Fig. 6). La presión de la columna durante los análisis se mantuvo constantemente en 23 bar (~334 psi).
Esto muestra que no se habían acumulado depósitos en la columna. Los ensayos en blanco al principio y al final no mostraron ningún cambio; es decir, no hubo contaminantes en la fase móvil. Se analizaron series estándar con diferentes concentraciones para determinar la reproducibilidad y el límite de detección. La rafinosa se da como ejemplo de estas series realizadas. Los tiempos de retención y las áreas de los picos se registraron y se enumeran en la Tabla 4. Los tiempos de retención consistentes obtenidos repetidamente muestran una reproducibilidad excelente.
La serie estándar de rafinosa muestra una curva lineal hasta una concentración de 0,015 mg/ml (Fig. 7). Al generar una línea estrecha estándar basada en las áreas de los picos, es posible una cuantificación de la muestra, en este caso rafinosa.
Conclusión
Los resultados muestran que el agua ultrapura producida por Arium® Pro VF se puede utilizar fácilmente como fase móvil para el análisis por HPLC de los sacáridos solubles en agua descritos en este artículo. Las interacciones de la muestra con la fase estacionaria no se ven afectadas por la fase móvil ya que el agua ultrapura que se produce con una conductividad de 0,055 µS/cm puede considerarse prácticamente libre de contaminantes. Como resultado, no hay sales presentes que de otro modo causarían picos fantasma o fantasmas.5 Además, los resultados de las pruebas llevan a la conclusión de que no se producen depósitos en la fase estacionaria, que de otro modo se manifestarían por un aumento de presión. y un cambio en los tiempos de ejecución de las muestras. Por lo tanto, el agua ultrapura Arium® Pro VF, que se puede preparar a pedido en cualquier momento, ofrece una alternativa asequible al agua ultrapura vendida comercialmente para preparar eluyentes de alta pureza para análisis HPLC, como se usa en análisis de alimentos, análisis ambientales y en medicina. , investigación química y bioquímica y durante pruebas de control de calidad en proceso en las industrias farmacéutica y biotecnológica.
Los estudios realizados y la excelente experiencia obtenida en el uso del agua ultrapura Arium® Pro VF como fase móvil en HPLC se extenderán en un futuro próximo a otras tecnologías de separación, como la cromatografía de fase reversa, la cromatografía de exclusión por tamaño o la cromatografía líquida de ultra alta resolución.
Referencias
1. Kromidas, Stavros: HPLC für Neueinsteiger, de Internet, © de Novia GmbH, (2000).
2. Hans Ulrich Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse Band II, Verlag Chemie, páginas 1179, 1180 (1970).
3. Dische, Z. y Borenfreund, E.: Un nuevo método espectrofotométrico para la detección de cetoazúcares y triosas, J. Biol. Química. 192, 583-587, (1951).
4. Süsswaren, número 10, página 7, LCI-Focus, (2006).
5. Gottwald, W.: RP-HPLC para Anwender. Reihe: Die Praxis der instrumentellen Analytik, Editor, Gruber, U., und Klein, W., VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, páginas 7-8 (1993).
6. Guía de productos de cromatografía 12/13, Phenomenex, páginas 232-233, (2012).
7. Weiß, Joachim: Ionenchromographie, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, capítulo 5, págs. 349 y siguientes. (2001)
