Introducción
Los ensayos ELISpot (Enzyme-Linked Immunospot) constituyen una de las herramientas más sensibles para estudiar moléculas secretadas por células individuales. Esta técnica es ampliamente utilizada en investigación en inmunología e inmuno-oncología para evaluar la respuesta funcional de células inmunitarias, especialmente leucocitos de sangre periférica y tejidos linfoides.
A diferencia de otras metodologías, ELISpot permite identificar y cuantificar células que están secretando activamente una determinada molécula, proporcionando información funcional que no puede obtenerse únicamente mediante la medición de proteínas circulantes o de la expresión génica.
Un ejemplo representativo son los monocitos, células fundamentales en la regulación de la respuesta inmune. Además de actuar como fagocitos frente a microorganismos invasores, secretan numerosas citocinas inmunorreguladoras que desempeñan un papel clave en la comunicación entre células del sistema inmunológico.
¿Por qué utilizar ELISpot?
Existen diferentes técnicas para evaluar la producción de citocinas, cada una con ventajas y limitaciones.
- ELISA: permite cuantificar citocinas presentes en fluidos biológicos como suero o plasma, aunque la presencia de proteínas de unión, la rápida degradación de las moléculas y otros factores pueden afectar la sensibilidad del ensayo.
- RT-PCR e hibridación in situ: evalúan la expresión del ARN mensajero, pero ésta no siempre refleja la cantidad real de proteína secretada.
- Citometría de flujo: ofrece información sobre proteínas sintetizadas dentro de la célula, aunque resulta menos adecuada para estudiar moléculas realmente secretadas y puede presentar dificultades cuando la frecuencia de células positivas es muy baja.
En este contexto, ELISpot ofrece una ventaja importante: permite identificar células individuales que están secretando activamente una proteína específica dentro de una población celular heterogénea. Diversos estudios han demostrado que esta metodología puede detectar incluso una única célula secretora entre aproximadamente un millón de células analizadas.
Principio de funcionamiento del ensayo ELISpot
El procedimiento experimental guarda una gran similitud con un ensayo ELISA tipo sándwich, aunque adaptado para trabajar con células completas sobre membranas especiales capaces de inmovilizar eficientemente los anticuerpos de captura.
- Inmovilización del anticuerpo de captura. La membrana de cada pocillo se recubre con el anticuerpo específico y posteriormente se eliminan los excesos mediante lavado.
- Bloqueo. Se incorporan soluciones bloqueantes para minimizar las uniones inespecíficas de proteínas. Muchos kits comerciales ya incluyen placas pretratadas con esta etapa realizada.
- Incorporación de las células. Las células se incuban junto con los estímulos experimentales, como antígenos o mitógenos. Durante la incubación, las proteínas secretadas quedan retenidas por los anticuerpos de captura exactamente en el lugar donde se encontraba la célula secretora.
- Adición del anticuerpo de detección. Tras eliminar las células mediante lavados, se incorpora un anticuerpo biotinilado específico para la molécula de interés.
- Incorporación del conjugado enzimático. Luego de un nuevo lavado se añade un conjugado estreptavidina-peroxidasa (u otra enzima equivalente) que permitirá la detección cromogénica.
- Revelado. Finalmente se agrega el sustrato correspondiente para desarrollar la coloración. Cada punto coloreado representa una célula secretora individual y posteriormente puede cuantificarse de forma manual o mediante sistemas automatizados de análisis de imágenes.
(Aquí irá la Figura 1 – Esquema del procedimiento ELISpot)
Automatización del lavado en ensayos ELISpot
La metodología ELISpot deriva conceptualmente del ensayo ELISA tipo sándwich, pero sustituye las placas convencionales de poliestireno por membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF), capaces de retener una mayor cantidad de anticuerpos de captura y mejorar la sensibilidad del ensayo.
Actualmente, el análisis automático de los puntos generados puede realizarse mediante equipos como el Agilent BioTek Cytation 7. Sin embargo, uno de los pasos que históricamente ha permanecido como un procedimiento manual es el lavado de las placas, una etapa crítica para obtener resultados reproducibles.
En este trabajo se evaluó el desempeño del lavador automático de microplacas Agilent BioTek 405 TS utilizando un ensayo ELISpot para cuantificar la secreción de interferón gamma (IFN-γ) por células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
El IFN-γ es una citocina glucoproteica de aproximadamente 14 a 18 kDa producida principalmente por linfocitos T CD8+ y células NK. Su secreción puede inducirse mediante el mitógeno fitohemaglutinina (PHA), lo que convierte este modelo experimental en una excelente alternativa para comparar el desempeño entre procedimientos de lavado manuales y automatizados.
Agilent BioTek 405 TS
El Agilent BioTek 405 TS es un lavador automático de microplacas diseñado para trabajar tanto con placas de 96 como de 384 pocillos sin necesidad de modificaciones mecánicas.
Su diseño incorpora colectores independientes para dispensación y aspiración, permitiendo realizar simultáneamente ambas operaciones durante el proceso de lavado. El sistema de dispensación posee una inclinación especialmente diseñada que genera un movimiento circular del líquido dentro de cada pocillo, mejorando significativamente la eficiencia del lavado y facilitando la eliminación de células y residuos adheridos a la membrana.
Además, el equipo puede programarse completamente desde su panel de control y almacenar hasta 75 protocolos diferentes. La posibilidad de combinar rutinas de cebado, dispensación y lavado permite adaptar fácilmente el instrumento a una gran variedad de ensayos inmunológicos.
Materiales y métodos
Para evaluar el desempeño del Agilent BioTek 405 TS se emplearon placas filtrantes MultiScreen® de 96 pocillos con membrana PVDF, anticuerpos monoclonales anti-IFN-γ humano de captura y detección, soluciones PBS libres de calcio y magnesio y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) previamente aisladas y conservadas a −80 °C.
Las membranas fueron pretratadas con etanol al 70 % para eliminar su hidrofobicidad y posteriormente lavadas con PBS antes de inmovilizar el anticuerpo de captura. Luego de una incubación durante la noche a 5 °C, se realizó el bloqueo de las placas utilizando suero fetal bovino al 10 % durante cuatro horas.
Posteriormente se sembraron distintas concentraciones de PBMC (25.000, 50.000, 100.000 y 200.000 células por pocillo), incluyendo controles negativos sin células. Cada condición fue incubada en presencia o ausencia del mitógeno fitohemaglutinina (PHA) durante toda la noche en incubadora con CO₂ a 37 °C.
Al finalizar la incubación, las placas fueron sometidas a seis ciclos de lavado con PBS-Tween 0,5 %, utilizando dos metodologías diferentes: lavado manual o lavado automatizado mediante el Agilent BioTek 405 TS. Para maximizar la eficiencia, las placas fueron rotadas 180° luego de los tres primeros ciclos automáticos antes de completar los tres ciclos restantes.
Posteriormente se incorporó el anticuerpo secundario biotinilado anti-IFN-γ, seguido de una nueva etapa de lavado y la adición del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina. Finalmente se realizó el revelado cromogénico mediante NBT/BCIP, deteniendo la reacción con agua desionizada antes del secado y análisis de las placas.
(Aquí irá la Tabla 1 – Parámetros de configuración del lavador Agilent BioTek 405 TS)
Resultados y discusión
El lavado automatizado mantiene la calidad del ensayo ELISpot
Uno de los principales objetivos del estudio fue comparar el desempeño del lavado automatizado realizado con el Agilent BioTek 405 TS frente al procedimiento manual tradicional. Para ello se evaluó la secreción de interferón gamma (IFN-γ) por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando el ensayo ELISpot.
Los resultados obtenidos muestran que ambos procedimientos generan patrones prácticamente equivalentes. Tanto en las placas lavadas manualmente como en aquellas procesadas automáticamente, las células no estimuladas presentaron una cantidad mínima de puntos ELISpot, independientemente del número inicial de células sembradas.
En cambio, cuando las PBMC fueron estimuladas con fitohemaglutinina (PHA), se observó un marcado incremento en el número de puntos detectados, evidenciando una mayor secreción de IFN-γ. Este comportamiento fue consistente en ambos métodos de lavado, lo que demuestra que la automatización no afecta la sensibilidad del ensayo.
(Aquí irá la Figura 2 – Comparación visual entre lavado manual y lavado automatizado)
La respuesta celular aumenta de forma proporcional al número de células
Otro aspecto importante observado durante el estudio fue que el número de puntos ELISpot aumentó proporcionalmente con la cantidad de células sembradas cuando éstas fueron estimuladas con PHA.
Esta relación confirma que los puntos detectados corresponden realmente a células secretoras activas y no a artefactos producidos por un lavado deficiente. Incluso con distintas concentraciones celulares, el procedimiento automatizado mantuvo resultados altamente comparables a los obtenidos mediante lavado manual.
En las muestras no estimuladas prácticamente no se detectaron células secretoras, mientras que las muestras estimuladas presentaron incrementos progresivos en función del número de PBMC analizadas, comportamiento esperado para este tipo de ensayos inmunológicos.
(Aquí irá la Figura 3 – Comparación entre PBMC estimuladas y no estimuladas)
Resultados equivalentes entre el lavado manual y el Agilent BioTek 405 TS
Cuando se comparó directamente el número de puntos obtenidos mediante ambos procedimientos de lavado, las diferencias fueron mínimas. Las placas procesadas con el Agilent BioTek 405 TS produjeron recuentos prácticamente idénticos a los obtenidos mediante el lavado manual en todas las condiciones evaluadas.
Estos resultados demuestran que la automatización permite conservar la calidad analítica del ensayo ELISpot mientras reduce significativamente la intervención manual del operador.
(Aquí irá la Figura 4 – Comparación cuantitativa entre lavado manual y automatizado)
La importancia de un lavado eficiente en ELISpot
El éxito de un ensayo ELISpot depende de numerosos factores experimentales, entre ellos la concentración de los anticuerpos primarios y secundarios, las condiciones de incubación, la composición de los buffers de lavado y el tiempo de revelado cromogénico. Sin embargo, una vez optimizados estos parámetros, la consistencia del lavado se convierte en un aspecto determinante para garantizar la reproducibilidad del ensayo.
Las membranas de PVDF utilizadas en ELISpot ofrecen una elevada capacidad para inmovilizar anticuerpos de captura, lo que contribuye a obtener puntos mejor definidos y una mayor sensibilidad. No obstante, estas mismas propiedades favorecen también la adhesión de células y residuos biológicos, dificultando su eliminación.
Si el lavado no es suficientemente eficiente, pueden permanecer restos celulares adheridos a la membrana que posteriormente se tiñen durante el revelado, generando señales inespecíficas o artefactos que dificultan la interpretación de los resultados e incluso pueden confundirse con verdaderas células secretoras.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que el Agilent BioTek 405 TS proporciona un lavado uniforme y reproducible, equivalente al método manual, reduciendo además la variabilidad asociada al operador y facilitando la estandarización de los ensayos ELISpot en laboratorios de investigación.
Resultados y discusión
Comparación entre el lavado automatizado y el lavado manual
Las evaluaciones realizadas mediante ELISpot demostraron que el lavado automatizado con el Agilent BioTek 405 TS ofrece resultados equivalentes a los obtenidos mediante el procedimiento manual.
En ambos métodos, las células no estimuladas presentaron una secreción mínima de IFN-γ, independientemente de la cantidad inicial de PBMC sembradas en cada pocillo. En las concentraciones celulares más bajas prácticamente no se observaron spots, mientras que la estimulación con PHA produjo un incremento considerable en la cantidad de spots detectados.
Estos resultados fueron consistentes tanto en las placas lavadas manualmente como en aquellas procesadas utilizando el lavador automático Agilent BioTek 405 TS.
Figura 2. Comparación representativa de placas ELISpot procesadas mediante lavado automatizado (A) y lavado manual (B).
La automatización mantiene la sensibilidad del ensayo
Cuando las PBMC fueron estimuladas con fitohemaglutinina (PHA), la secreción de IFN-γ aumentó significativamente, reflejándose en un mayor número de spots detectados por el sistema ELISpot.
Además, el número de spots observados aumentó de forma proporcional a la cantidad de células sembradas inicialmente, lo que demuestra que los resultados obtenidos no son consecuencia de un lavado insuficiente, sino de una verdadera respuesta biológica.
La comparación entre ambos métodos mostró que las placas procesadas con el Agilent BioTek 405 TS produjeron prácticamente el mismo número de spots que aquellas lavadas manualmente, confirmando que la automatización no compromete la sensibilidad ni la calidad analítica del ensayo.
Figura 3. Comparación entre PBMC estimuladas y no estimuladas utilizando ELISpot con lavado manual y automatizado.
Importancia de un lavado uniforme para obtener resultados reproducibles
Durante el estudio se evaluó específicamente la capacidad del lavador de microplacas Agilent BioTek 405 TS para realizar las etapas críticas de lavado sobre placas ELISpot con membrana de 96 pocillos.
Los resultados demostraron que el equipo constituye una alternativa confiable al lavado manual, permitiendo obtener datos altamente reproducibles y minimizando la variabilidad entre operadores.
Los autores destacan que el rendimiento del ensayo ELISpot depende de numerosos parámetros previamente optimizados, entre ellos:
- Concentración del anticuerpo de captura.
- Concentración del anticuerpo de detección.
- Tiempos y temperaturas de incubación.
- Composición del buffer de lavado.
- Tiempo de desarrollo del color.
Una vez establecidos estos parámetros, la consistencia del proceso de lavado se convierte en uno de los factores más importantes para asegurar resultados repetibles entre diferentes placas y experimentos.
¿Por qué el lavado es tan importante en los ensayos ELISpot?
Las membranas utilizadas en ELISpot poseen una elevada capacidad para retener anticuerpos de captura, característica que mejora la intensidad y definición de los spots detectados. Sin embargo, esa misma propiedad favorece la adhesión de células y restos celulares sobre la membrana.
Si estos residuos no se eliminan correctamente durante el lavado, pueden teñirse de forma inespecífica durante el revelado y generar un fondo elevado o incluso producir señales que podrían confundirse con spots verdaderos.
Por este motivo, un procedimiento de lavado uniforme y eficiente resulta indispensable para garantizar la precisión del conteo automático y la confiabilidad de los resultados obtenidos mediante ELISpot.
Figura 4. Comparación entre el lavado manual y automatizado en PBMC estimuladas con PHA.
Preguntas frecuentes
Palabras finales sobre la automatización del lavado en ensayos ELISpot
Los ensayos ELISpot continúan siendo una de las metodologías más sensibles para evaluar la respuesta inmunológica a nivel celular, permitiendo identificar y cuantificar células individuales que secretan citocinas específicas. Su aplicación es cada vez más frecuente en investigación básica, inmunoterapia, desarrollo de vacunas y estudios preclínicos.
Los resultados presentados demuestran que el Agilent BioTek 405 TS permite automatizar una de las etapas más críticas y laboriosas del protocolo: el lavado de las placas con membrana. El equipo ofrece un desempeño equivalente al lavado manual, manteniendo la sensibilidad del ensayo y proporcionando una mayor reproducibilidad entre experimentos.
Además de reducir la variabilidad asociada al operador, la automatización mejora la eficiencia del laboratorio, facilita la estandarización de protocolos y permite procesar un mayor número de muestras con resultados consistentes. Para laboratorios que realizan ensayos ELISpot de manera rutinaria, incorporar un sistema automatizado de lavado representa una mejora significativa tanto en productividad como en calidad analítica.
