La evaluación de la viabilidad celular es una herramienta fundamental en investigación biomédica, ya que permite determinar cómo responden las células frente a distintos estímulos, como fármacos, compuestos antitumorales, factores de crecimiento o agentes tóxicos. Este tipo de análisis resulta esencial en áreas como el desarrollo de nuevos medicamentos, la investigación oncológica y los estudios de citotoxicidad.
Entre las metodologías disponibles, los ensayos colorimétricos basados en sales de tetrazolio se destacan por su simplicidad, rapidez y facilidad de adaptación al formato de microplacas. Uno de los más utilizados es el ensayo MTT, que permite estimar la viabilidad y proliferación celular a partir de la actividad metabólica de las células vivas.
En este trabajo se evaluó la capacidad del espectrofotómetro de microplacas Agilent BioTek Epoch para cuantificar el efecto citotóxico de la tiostreptona (thiostrepton) sobre células de mesotelioma humano utilizando el kit Vybrant® MTT Cell Proliferation Assay. El estudio demuestra cómo la combinación de un ensayo MTT con un lector de absorbancia permite obtener mediciones precisas y reproducibles de la viabilidad celular.
- El ensayo MTT permite evaluar de forma rápida y reproducible la viabilidad y proliferación celular mediante una medición colorimétrica de la actividad metabólica.
- El Agilent BioTek Epoch cuantifica la absorbancia a 570 nm con alta precisión, permitiendo obtener curvas de calibración y dosis-respuesta confiables.
- La combinación del ensayo MTT con microplacas de 96 pocillos facilita el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras.
- En este estudio, el sistema permitió cuantificar el efecto citotóxico de la tiostreptona sobre células de mesotelioma humano, obteniendo una EC50 de aproximadamente 3,5 µM.
- Esta metodología resulta ideal para estudios de citotoxicidad, proliferación celular, desarrollo de fármacos e investigación oncológica.
¿Por qué utilizar un ensayo MTT para evaluar viabilidad celular?
La cuantificación de la respuesta celular frente a distintos tratamientos puede realizarse mediante diversas técnicas, cada una con ventajas y limitaciones.
- Recuento celular manual o automatizado: permite determinar el número de células presentes, aunque suele requerir mayor tiempo de procesamiento y manipulación de las muestras.
- Análisis microscópico: proporciona información morfológica, pero resulta menos práctico cuando se procesan grandes cantidades de muestras.
- Ensayos colorimétricos y fluorométricos: ofrecen una alternativa rápida, sencilla y fácilmente escalable para estudios de proliferación y citotoxicidad en microplacas.
Dentro de este grupo, el ensayo MTT es una de las metodologías más utilizadas para estimar el número de células viables. La técnica se basa en la reducción enzimática del compuesto MTT por células metabólicamente activas, generando cristales de formazán de color púrpura cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de células vivas presentes en la muestra.
Figura 1. Reducción del reactivo MTT por enzimas mitocondriales de células viables, dando origen a cristales de formazán detectables por absorbancia a 570 nm.
Tras la solubilización de los cristales de formazán, la absorbancia se mide a 570 nm mediante un lector de microplacas. La señal obtenida es proporcional a la actividad metabólica y, por lo tanto, a la viabilidad celular, lo que convierte al ensayo MTT en una herramienta ampliamente utilizada para estudios de proliferación, citotoxicidad y evaluación de compuestos con potencial terapéutico.
Agilent BioTek Epoch
El Agilent BioTek Epoch es un espectrofotómetro de microplacas diseñado para realizar una amplia variedad de ensayos colorimétricos basados en absorbancia. Además de analizar microplacas convencionales, el sistema puede configurarse como un espectrofotómetro multivolumen, incorporando la placa Take3™, que permite cuantificar ácidos nucleicos y proteínas utilizando volúmenes de muestra de apenas 2 µL.
Esta versatilidad permite que un único equipo se utilice tanto para ensayos de viabilidad celular en microplacas como para la cuantificación de ADN, ARN y proteínas mediante mediciones de microvolumen o cubetas espectrofotométricas convencionales.
Figura 2. Sistema Agilent BioTek Epoch Multi-Volume Spectrophotometer, que combina el espectrofotómetro Epoch, la placa Take3™ para microvolúmenes y la compatibilidad con microplacas estándar.
Materiales y métodos
Todas las determinaciones se realizaron utilizando el Agilent BioTek Epoch junto con microplacas de 96 pocillos. Para evaluar el efecto citotóxico de la tiostreptona se empleó el kit Vybrant® MTT Cell Proliferation Assay, medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino (FBS) y células primarias de mesotelioma humano.
Inicialmente se preparó una curva de calibración celular sembrando distintas concentraciones de células en microplacas de 96 pocillos. Después de una incubación durante la noche a 37 °C y en una atmósfera con 5 % de CO₂, se realizó el ensayo MTT siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Antes de incorporar el reactivo MTT se retiró el medio de cultivo y se añadieron 100 µL de medio fresco junto con 10 µL de reactivo MTT recién preparado. Las placas se incubaron durante cuatro horas para permitir la formación de cristales de formazán.
Posteriormente se agregó una solución de SDS-HCl para solubilizar los cristales generados. Tras una nueva incubación durante la noche, la absorbancia se midió a 570 nm utilizando el espectrofotómetro Agilent BioTek Epoch. El control del equipo y el procesamiento de los datos se realizaron mediante el software Gen5™.
Para evaluar la citotoxicidad de la tiostreptona, las células de mesotelioma se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo. Luego del crecimiento inicial, se trataron con concentraciones crecientes del compuesto, desde 20 µM hasta 0,0195 µM, manteniendo ocho réplicas para cada concentración.
Después de 24 horas de exposición al tratamiento se realizó nuevamente el ensayo MTT. Todas las lecturas fueron corregidas utilizando como blanco los pocillos que contenían únicamente medio de cultivo y reactivo MTT.
Resultados
Curva de calibración de células de mesotelioma
Como primer paso se construyó una curva estándar utilizando diferentes concentraciones de células de mesotelioma humano. Las lecturas de absorbancia obtenidas a 570 nm fueron corregidas mediante la sustracción del blanco correspondiente.
Los resultados mostraron una relación lineal entre el número de células sembradas y la absorbancia registrada, confirmando que el ensayo MTT permite estimar de forma confiable la cantidad de células metabólicamente activas presentes en cada pocillo.
Figura 3. Curva estándar obtenida mediante diluciones seriadas de células de mesotelioma utilizando el ensayo Vybrant® MTT. La absorbancia a 570 nm aumenta proporcionalmente con el número de células viables.
Evaluación de la citotoxicidad de la tiostreptona
Una vez obtenida la curva de calibración, se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de tiostreptona (thiostrepton) sobre la viabilidad de células de mesotelioma humano mediante el ensayo MTT.
Los datos obtenidos permitieron construir una curva dosis-respuesta con el comportamiento sigmoidal característico de los ensayos de viabilidad celular. A partir de esta curva se calculó una EC50 de 3,5 µM, correspondiente a la concentración necesaria para reducir la viabilidad celular en un 50 % bajo las condiciones experimentales evaluadas.
Estos resultados demuestran que el ensayo MTT, combinado con el Agilent BioTek Epoch, permite cuantificar de manera precisa la respuesta celular frente a agentes citotóxicos y generar curvas de dosis-respuesta reproducibles para estudios farmacológicos y de investigación oncológica.
Figura 4. Curva dosis-respuesta de la tiostreptona sobre células de mesotelioma. La EC50 calculada fue de aproximadamente 3,5 µM.
Los resultados concuerdan con estudios previos
El valor de EC50 obtenido fue consistente con investigaciones previamente publicadas, las cuales describen que la tiostreptona induce apoptosis en distintas líneas celulares mediante la inhibición del factor de transcripción FoxM1. En dichos estudios se informaron concentraciones efectivas dentro del rango micromolar bajo, similares a las observadas en este trabajo.
La concordancia entre los resultados experimentales y la bibliografía disponible respalda la confiabilidad del método y confirma la utilidad del ensayo MTT como herramienta para evaluar la actividad citotóxica de compuestos con potencial terapéutico.
Preguntas frecuentes
Palabras finales
El ensayo MTT constituye una metodología sencilla, segura y confiable para evaluar la viabilidad y proliferación celular frente a distintos estímulos experimentales. Su fundamento colorimétrico permite adaptar fácilmente el procedimiento al formato de microplacas, facilitando el análisis de un gran número de muestras con elevada reproducibilidad.
En este estudio, el Agilent BioTek Epoch permitió cuantificar de forma precisa la respuesta de células de mesotelioma tratadas con tiostreptona, generando curvas de calibración y dosis-respuesta consistentes mediante mediciones de absorbancia a 570 nm.
La combinación del ensayo Vybrant® MTT con el espectrofotómetro Epoch representa una solución eficiente para laboratorios dedicados a estudios de citotoxicidad, proliferación celular, desarrollo de fármacos e investigación biomédica, ofreciendo resultados confiables y fácilmente reproducibles.
Referencias
- Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 1983;65:55-63.
- Held P. An Absorbance-based Cytotoxicity Assay using High Absorptivity, Water-soluble Tetrazolium Salts. BioTek Instruments Application Note. 2009.
- Bhat UG, Halasi M, Gartel AL. Thiazole Antibiotics Target FoxM1 and Induce Apoptosis in Human Cancer Cells. PLoS ONE. 2009;4(5):e5592.
