Para cuantificar ácidos nucleicos, ADN o ARN, los científicos suelen utilizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).
Los pasos clave al inicio simplifican la optimización y la validación
La qPCR, como todos los métodos de PCR, amplifica los ácidos nucleicos, pero también monitorea el proceso en tiempo real. Al poner en funcionamiento la tecnología qPCR, los científicos deben diseñar y validar ensayos. Esto plantea una variedad de desafíos en varios aspectos de este proceso.
Los desafíos clave al diseñar ensayos de qPCR son seleccionar los cebadores y las secuencias de las sondas, así como los colorantes indicadores. Esto puede resultar particularmente difícil para los ensayos multiplex. También puede resultar difícil equilibrar la elección de secuencias de oligo y químicas de detección compatibles con la instrumentación de qPCR disponible. Cuantos más objetivos quiera detectar un usuario en un ensayo multiplex, más precario puede ser este equilibrio.
Los desafíos adicionales complican aún más la etapa de diseño. Por ejemplo, los usuarios deben obtener la información de secuencia más actualizada y evitar variaciones de secuencia como SNP, inserciones, eliminaciones y secuencias de baja complejidad. Con esa información, un científico debe asegurarse de que la sonda se dirija a una secuencia única y no a múltiples fragmentos del genoma.
Las características del objetivo afectan el funcionamiento de la PCR. Por ejemplo, es mejor diseñar ensayos entre uniones exón-exón para no detectar ADN genómico objetivo. Los usuarios también deben considerar si quieren detectar una transcripción específica o diferentes variantes de transcripción del mismo gen. Para los experimentos transgénicos, los científicos deberían buscar objetivos específicos de cada especie.
Detalles de diseño de ensayos qPCR
Algunos avances en la tecnología qPCR facilitan el diseño de nuevos ensayos. La instrumentación qPCR está disponible con múltiples canales que pueden simplificar el diseño de experimentos al ampliar las posibilidades de diseño para oligos y sondas. En términos de reactivos, la introducción continua de nuevas químicas de sondas puede ayudar a agregar flexibilidad al diseño de ensayos. Para un nuevo ensayo de qPCR, considere utilizar una herramienta de diseño.
Optimización del ensayo qPCR
Una vez que un científico diseña un ensayo, queda más trabajo por hacer, como optimizarlo. Para que los ensayos de qPCR sean exitosos, se deben optimizar variables como las concentraciones de componentes y los parámetros de ciclo térmico. La optimización de matrices qPCR puede ser muy compleja y debe incluir pruebas de material de muestra representativo.
El nivel de optimización necesario depende de la calidad del diseño. Un buen diseño del ensayo significa menos trabajo a la hora de optimizar el ensayo. Por ejemplo, los cebadores y las sondas deben diseñarse a temperaturas uniformes. Si el diseño no se construye con el suficiente cuidado, se requerirá más trabajo para que el ensayo se realice de la manera más eficiente posible. Si no optimiza el diseño de su ensayo desde el principio, será necesario trabajar para encontrar las mejores temperaturas de recocido y extensión no solo para sus cebadores y sondas, sino también para su mezcla maestra e instrumentación.
La optimización puede resultar más difícil en algunas situaciones que en otras. Si el material de muestra es escaso, la disponibilidad para experimentos de optimización de ensayos se vuelve problemática.
Para obtener mejores resultados en la optimización, los científicos podrían buscar características específicas en la tecnología qPCR. Por ejemplo, la instrumentación con potencial de alto rendimiento puede facilitar la optimización. Estos instrumentos pueden tener ciclos térmicos rápidos, automatización como estaciones de pipeteo robóticas u otras características para acelerar el proceso. La ejecución de múltiples perfiles de ciclo térmico al mismo tiempo también acelera la rapidez con la que un científico puede optimizar un ensayo.
Los reactivos también influyen en la optimización. Regularmente se introducen nuevos productos de mezcla maestra que pueden permitir la eliminación de ciertos parámetros de la matriz de optimización, como el MgCl2 o la concentración de enzimas. Esto puede reducir la cantidad de optimizaciones que se deben realizar antes de que un ensayo esté en funcionamiento.
La optimización del ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) es crucial para obtener resultados precisos y reproducibles, especialmente en la aplicación de análisis de expresión génica. En este contexto, se busca maximizar la eficiencia de amplificación y minimizar la variabilidad entre muestras. Para lograrlo, se deben optimizar varios parámetros, como la concentración de cebadores y ADN molde, la temperatura de hibridación y la ciclación de temperatura. Además, es fundamental realizar controles de calidad adecuados y estandarizar los procedimientos experimentales. Al mejorar la sensibilidad y la especificidad del ensayo qPCR, se garantiza una medición precisa de la expresión génica, lo que permite una mejor comprensión de los procesos biológicos subyacentes. Estas prácticas de optimización son esenciales en las aplicaciones de la PCR en la Ciencia Moderna, donde la precisión y la fiabilidad de los datos son fundamentales para avanzar en nuestro conocimiento científico.
La validación es necesaria
Después de seguir los pasos para diseñar y optimizar un ensayo de qPCR, es necesario validarlo para demostrar que realmente hace lo que se supone que debe hacer. Uno de los aspectos más desafiantes de la validación puede ser evaluar la variación introducida por diferentes plataformas qPCR. Puede resultar frustrante descubrir que el instrumento utilizado para desarrollar su ensayo qPCR es propenso a grandes variaciones entre instrumentos.
El esfuerzo requerido en la validación a menudo depende de la aplicación en cuestión. En muchos casos, los ensayos disponibles comercialmente serán suficientes. Sin embargo, cuando sea necesario, se pueden desarrollar ensayos de qPCR completamente novedosos para aplicaciones específicas. Al combinar la qPCR y los reactivos adecuados, además de la experiencia y las herramientas de diseño cuando sea necesario, los científicos pueden diseñar, optimizar y validar ensayos.
Autor: Mike May, PhD
Fuente: LabManager. Designing qPCR Assays
